میزان جذب نوری (OD) آنها در طول موج ۵۷۰ نانومتر توسط میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شد.
۳-۱۲. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی
به منظور بررسی اثرات تیمار LPS بر تغییرات سطح COX-2، سلولها با غلظتهای مختلف LPS شامل۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ ، ۱ میکروگرم بر میلی‌لیتر و ۳۱۶، ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ نانوگرم بر میلی‌لیتر در مدت زمان‌های ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت مجاور شدند و اندازه‌گیری سطح COX-2 در نمونههای لیز شده سلولی انجام شد.
۳-۱۲-۱. مواد
سلول‌های فیبروبلاست پاساژ ۱۰
LPS
کیت سنجش COX-2 (Assay designs & Stressgen Inc. Michigan, USA),
۳-۱۲-۲. آماده‌سازی محلولها:
بافر شستشو: ۲۵ ml بافر تغلیظ شده موجود در کیت با ۹۷۵ ml آب مقطر دیونیزه مخلوط گردید.
استاندارد COX-2: ابتدا µl 500 آب دیونیزه به ویال حاوی استاندارد COX-2 موجود در کیت اضافه شده و محلولی با غلظت ng/ml 550 تهیه گردید. برای تهیه استانداردهای بعدی، ابتدا هفت میکروتیوب را شماره‌گذاری کرده و سپس ۷۵۰µlبافر سنجش در میکروتیوب شماره ۱ و µl 500 بافر در هر یک از تیوبهای ۲ تا ۷ ریخته شد. در مرحله بعد µl 250 از استاندارد ng/ml 550‌ تازه تهیه شده به تیوب شماره ۱ اضافه شده و به خوبی مخلوط گردید. سپس از محتویات ظرف شماره ۱، µl 500‌ برداشته و به تیوب شماره ۲ اضافه گردید و همین روند تا تیوب هفتم تکرار شد. به این ترتیب استانداردهایی با غلظتهای ۷۰، ۳۵، ۵/۱۷، ۷۵/۸، ۳۸/۴، ۱۹/۲، ۰۹/۱ ng/ml در میکروتیوبهای ۱ تا ۷ تهیه گردید.
کنژوگه آنتی بادی نشاندار شده: تمام حجم محلول موجود در یکی از ظرفهای محتوی محلول رقیق کننده آنتی‌بادی را به ویال حاوی کنژوگه آنتی‌بادی اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق به آرامی ‌ورتکس گردید.
۳-۱۲-۳. آماده‌سازی نمونه
برای تهیه لیزات سلولی، پس از برداشت سلولها به وسیله rubber policemen، سلولها را با دور ۱۰۰۰g به مدت ۱۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ شدند. سپس مایع رویی را دور ریخته و تکمه سلولی حاصل را با ۱-۲ml بافر سرد (۵mM پتاسیم فسفات pH 7.4، محتوی ۹/۰% سدیم کلراید و ۱/۰% گلوکز) هموژنیزه می‌کنیم. سپس سلولها را با دور ۱۰۰۰۰ g به مدت ۱۵ دقیقه در ۴ درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ کرده و مایع رویی را دور می‌ریزیم.
۳-۱۲-۴. روش کار


0 Comments

No Comment.

Related Posts

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد حقوق مالکیت فکری

می آید که کشورهای عضو می توانند ضمانت اجراهای کیفری نیز برای مقابله با اعمال ناقض حقوق مالکیت فکری اتخاذ کنند. دستورالعمل همچنین بر موثر و متناسب بودن و ویژگی پیشگیرانه این ضمانت اجراها تأکید Read more…

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد حقوق مالکیت فکری

این عنوان مورد حمایت واقع شده اند.   با این حال، با کمال تعجب ماده 108 قانون مالکیت فکری آلمان ناظر بر حمایت کیفری از حقوق جانبی که پیش تر در مورد آن صحبت شد، Read more…

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد مقررات بین المللی

مقامهای آنان باشد. مرتکبان این جرائم هم، هر کسی است که نسبت به ثبت یا ضبط آثار به هر وسیله ای و بر روی هر واسطی بدون اجازه صاحبان حقوق به مفهوم عام کلمه اقدام Read more…