دانلود پایان نامه

میزان جذب نوری (OD) آنها در طول موج ۵۷۰ نانومتر توسط میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شد.
۳-۱۲. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی
به منظور بررسی اثرات تیمار LPS بر تغییرات سطح COX-2، سلولها با غلظتهای مختلف LPS شامل۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ ، ۱ میکروگرم بر میلی‌لیتر و ۳۱۶، ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ نانوگرم بر میلی‌لیتر در مدت زمان‌های ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت مجاور شدند و اندازه‌گیری سطح COX-2 در نمونههای لیز شده سلولی انجام شد.
۳-۱۲-۱. مواد
سلول‌های فیبروبلاست پاساژ ۱۰
LPS
کیت سنجش COX-2 (Assay designs & Stressgen Inc. Michigan, USA),
۳-۱۲-۲. آماده‌سازی محلولها:
بافر شستشو: ۲۵ ml بافر تغلیظ شده موجود در کیت با ۹۷۵ ml آب مقطر دیونیزه مخلوط گردید.
استاندارد COX-2: ابتدا µl 500 آب دیونیزه به ویال حاوی استاندارد COX-2 موجود در کیت اضافه شده و محلولی با غلظت ng/ml 550 تهیه گردید. برای تهیه استانداردهای بعدی، ابتدا هفت میکروتیوب را شماره‌گذاری کرده و سپس ۷۵۰µlبافر سنجش در میکروتیوب شماره ۱ و µl 500 بافر در هر یک از تیوبهای ۲ تا ۷ ریخته شد. در مرحله بعد µl 250 از استاندارد ng/ml 550‌ تازه تهیه شده به تیوب شماره ۱ اضافه شده و به خوبی مخلوط گردید. سپس از محتویات ظرف شماره ۱، µl 500‌ برداشته و به تیوب شماره ۲ اضافه گردید و همین روند تا تیوب هفتم تکرار شد. به این ترتیب استانداردهایی با غلظتهای ۷۰، ۳۵، ۵/۱۷، ۷۵/۸، ۳۸/۴، ۱۹/۲، ۰۹/۱ ng/ml در میکروتیوبهای ۱ تا ۷ تهیه گردید.
کنژوگه آنتی بادی نشاندار شده: تمام حجم محلول موجود در یکی از ظرفهای محتوی محلول رقیق کننده آنتی‌بادی را به ویال حاوی کنژوگه آنتی‌بادی اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق به آرامی ‌ورتکس گردید.
۳-۱۲-۳. آماده‌سازی نمونه
برای تهیه لیزات سلولی، پس از برداشت سلولها به وسیله rubber policemen، سلولها را با دور ۱۰۰۰g به مدت ۱۰ دقیقه در ۴ درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ شدند. سپس مایع رویی را دور ریخته و تکمه سلولی حاصل را با ۱-۲ml بافر سرد (۵mM پتاسیم فسفات pH 7.4، محتوی ۹/۰% سدیم کلراید و ۱/۰% گلوکز) هموژنیزه می‌کنیم. سپس سلولها را با دور ۱۰۰۰۰ g به مدت ۱۵ دقیقه در ۴ درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ کرده و مایع رویی را دور می‌ریزیم.
۳-۱۲-۴. روش کار


0 Comments

No Comment.