دانلود پایان نامه

افزایش آنژیوژنز و گشادی رگ‌ها در زخم ایجاد شده در سگ‌ها شد (۸۸).

فصل سوم
مواد و روش‌ها

۳-۱. مواد و وسایل و دستگاه های بکار رفته در آزمایش
موش Balb/c (8-12 هفته)
لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا
کیت سنجش نیتریک اکسید
کیت سنجش هیدروژن پراکسید
کیت سنجش سیکلواکسیژناز-۲
کتامین
زایلازین
مورفین
پتیدین
جنتامایسین
ست جراحی
PBS
فرمالین ۱۰%
اتانول ۷۰%
لایزینگ بافر
سلول‌های فیبروبلاست
FBS
تریپسین
محیط کشت DMEM
XTT
PMS
پنیسیلین استرپتومایسین
رنگ تریپان بلو
لام نئوبار
بیوپسی پانچر
هود لامینار
انکوباتور CO2
میکروسکوپ اینورت
پیپت پاستور ۱۰ ml
فلاسک کشت ۲۵, ۷۵ cm2
فالکن ۱۵, ۵۰ ml
تیوب‌های استریل ۲ ml
پلیت ۹۶ خانه
الایزا ریدر
پیپتور
ورتکس
سمپلر و سر سمپلر

۳-۲. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته
۳-۲-۱. محیط کشت DMEM
محیط کشت DMEM با گلوکز بالا و غنی شده با L-glutamate به صورت آماده از شرکت آریوژن خریداری می‌گردید. بسته‌های خریداری شده به حجم ۵۰۰ ml بود و به منظور جلوگیری از آلودگی، در فالکون‌های ۵۰ ml تقسیم شده و در یخچال نگهداری شدند.
FBS
در این پژوهش از سرم جنین گاو استفاده شد. نقش سرم در محیط کشت تأمین فاکتور‌های رشد هورمون‌ها و برخی اسید آمینه‌ها و پیش‌ساز‌های اسید نوکلئیک و اسید چرب می‌باشد. به منظور غیر فعال کردن کمپلمان موجود در آن، در بن ماری در دمای ۵۶ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه حرارت داده شد. پس از غیر فعال کردن کمپلمان‌ها، FBS در لوله‌های فالکون استریل تقسیم و در فریزر ۲۰- درجه نگهداری شد. میزان مصرف آن در محیط کشت DMEM 10% می‌باشد.
۳-۲-۲. بافر PBS
یک عدد قرص PBS در ۲۰۰ ml آب مقطر دو بار تقطیر حل شد. سپس با استفاده از فیلتر استریل شده و در لوله‌های فالکون ۵۰ ml استریل، الیکوت و در ۲۰- نگهداری شد.
۳-۳. کشت سلول‌های فیبروبلاست
سلول‌های فیبروبلاست از بانک سلولی آزمایشگاه کشت سلولی دانشگاه تربیت مدرس تهیه شده و در شرایطی استریل به آزمایشگاه مربوطه منتقل شدند. به منظور آماده‌سازی محیط کشت فیبروبلاست، به محیط کشت DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco) FBS و پنسیلین- استرپتومایسین در شرایط کاملاً استریل مخلوط و در یخچال نگهداری شد. هر بار پیش از مصرف، دمای آن به کمک حمام آب گرم به ۳۷ درجه سانتی‌گراد رسانیده می‌شد. محیط کشت DMEM مشتق از MEM می‌باشد که حاوی حداقل مواد لازم برای رشد سلول (اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و نمک‌ها) می‌باشد. بافر PBS به صورت استریل و از اختلاط KCl،KH2PO2 ، NaCl، Na2HPO4 تهیه و به عنوان محلول شستشو قبل از جداسازی سلول‌ها و همچنین به عنوان رقیق کننده تریپسین مورد استفاده قرار گرفت. این بافر هم در یخچال نگهداری و قبل از مصرف به دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد رسانیده شد.
سلول‌های فیبروبلاست تحت شرایط استریل در فلاسک T-75 و در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه و %۵ CO2و رطوبت ۹۵% کشت داده شدند. سلول‌ها هر روز برای بررسی میزان رشد و تکثیر و همچنین آلودگی احتمالی یا تخریب سلولی زیر میکروسکوپ معکوس مورد مشاهده قرار گرفتند و محیط کشت آنها به هنگام لزوم (مثلاً کاهش pH محیط و تغییر رنگ آن از قرمز به زرد) تعویض گردید. هنگامی‌که سلول‌ها تقریباً ۹۰% سطح فلاسک را می‌پوشاندند، پاساژ سلولی انجام می‌گرفت و پس از پاساژ دهم، از سلول‌ها برای انجام مطالعات سیتوتوکسیسیتی استفاده شد. برای پاساژ، مایع رویی فلاسک دور ریخته شد و برای اینکه محیط کشت به طور کامل خارج شود محلول استریل PBS اضافه گردیده و تخلیه شد. در این مرحله به فلاسک عاری از محیط کشت، تریپسین آماده اضافه شد و فلاسک به مدت یک دقیقه در انکوباتور نگهداری شد تا سلول‌های چسبیده به کف جدا شده و به صورت معلق درآیند. سپس محتویات فلاسک به لوله‌های فالکن استریل منتقل شدند تا با دور RPM 1500‌ به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شوند. پس از اتمام سانتریفیوژ، مایع رویی فالکن‌ها در زیر هود تخلیه شده و مجدداً محیط کشت اضافه شد و با عمل پیپتاژ کلمپ‌های سلولی از هم باز شدند. در این مرحله سلول‌های موجود در سوسپانسیون بدست آمده با استفاده از رنگ‌آمیزی تریپان بلو و لام نئوبار با کمک میکروسکوپ معکوس، شمارش شدند.
۳-۴. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید
در این تحقیق از LPS سالمونلا انتریکا که از شرکت سیگما خریداری شده بود برای تیمار فیبروبلاست‌ها استفاده شد. به منظور جلوگیری از آلودگی، محلول استوک LPS به میزان ۲/۰ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در آب دو بار تقطیر استریل تهیه شده و در میکروتیوب‌های استریل در یخچال نگهداری شدند. جهت رقیق‌سازی LPS و بدست آوردن غلظت‌های مختلف از محیط کشت فیبروبلاست به عنوان رقیق کننده استفاده گردید. غلظت‌ها به صورت نیم لگاریتمی‌ و در محدوده‌ی ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳، ۱ میکرو گرم تا ۳۱۶، ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ نانوگرم تهیه شدند. با توجه به اینکه LPS تمایل زیادی به چسبیدن به دیواره‌ی ظرف دارد قبل از هر بار استفاده عمل ورتکس انجام می‌گردید.
۳-۵. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها
پس از تهیه‌ی غلظت‌های مختلف LPS، محتویات هر میکروتیوب به ردیف‌های traff 12 خانه منتقل شدند. برای تیمار، سلول‌ها به دو گروه تقسیم‌بندی شدند. گروه اول گروهی بود که تیمار آنها بدون انکوباسیون ۲۴ ساعته بود یع
نی دقیقاً همان روزی که سلول‌ها در پلیت کشت داده شدند بدون هیچ وقفه‌ای تیمار هم برای آنها انجام گرفت. گروه دوم گروهی بود که سلول‌هایی که از ۲۴ ساعت قبل در پلیت‌های ۹۶ خانه در انکوباتور کشت داده شده بودند توسط LPS تیمار گردیدند. به ازای هر ۵۰ ماکرولیتر سلول، ۵۰ ماکرو لیتر هم از غلظت‌های مختلف LPSدر هر ردیف اثر داده شد. سپس پلیت‌های تیمار داده شده به مدت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت در انکوباتور نگهداری شدند تا برای رنگ‌آمیزی XTT آماده شوند.
۳-۶. رنگ‌آمیزی XTT
۲۴ ساعت قبل از انجام این رنگ‌آمیزی، سلول‌ها در پلیت ۹۶ خانه کشت داده شدند. بطوری که به هر چاهک ۱۰۰ ماکرولیتر از محیط کشت اضافه گردید. هر تست یک بلانک داشت که فقط حاوی محیط کشت بود. برای شروع کار، معرف XTT و معرف فعال کننده PMS سریعاً قبل از آغاز آزمایش به دمای ۳۷ درجه رسانیده شد. برای آماده‌سازی محلول واکنشگر کافی برای یک پلیت ۹۶ خانه ۱۲۰ ماکرولیتر PMS و ۶ میلی‌لیتر XTT نیاز بود. بعد از اضافه کردن محلول واکنشگر به هر چاهک، پلیت مربوطه به مدت ۲ و ۴ ساعت در انکوباتور نگهداری شد. سپس میزان جذب نوری نمونه‌ها توسط الایزا ریدر (ELISA-reader) با طول موج ۴۵۰-۵۰۰ نانومتر سنجیده شد.
حساسیت روش XTT به دلیل حضور یک عامل فعال کننده به نام PMS (N- متیل دی بنزوپیرازین متیل سولفات) که نوعی حامل الکترون واسطه است تقویت می‌شود. ترکیب PMS به احیای XTT و تشکیل مشتقات فورمازان کمک می‌کند. روش XTT به دلیل عدم استفاده از ایزوتوپ‌های رادیواکتیو ایمن‌تر از MTT می‌باشد. با توجه به اینکه جذب رنگ در این روش متناسب با تعداد سلول‌ها در هر چاهک است دقیق‌تر از MTT می‌باشد. این روش طی یک مرحله در دو ساعت جواب می‌دهد. در این روش به غیر از دو معرف XTT و PMS هیچ معرف اضافی دیگر و شستشوی سلولی مورد نیاز نیست.

شکل ۳-۱. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی

۳-۷. رنگ‌آمیزی تریپان بلو
این آزمایش برآوردی تقریبی از viability سلول‌ها بود که بر اساس عدم جذب رنگ تریپان بلو توسط سلول‌های زنده استوار می‌باشد. در حالی که سلول‌های مرده نسبت به این رنگ نفوذپذیر بودند. این رنگ تمایل زیادی به پروتئین‌های موجود در سرم دارد به همین دلیل قبل از رنگ‌آمیزی سلول‌ها به خوبی با PBS شسته داده شدند تا پروتئین‌های باقی مانده سرم کاملاً از محیط خارج شوند.
Mg400 پودر تریپان بلو را وزن کرده و در آب مقطر به حجم ۱۰۰ ml رسانده شد. سپس محلول را از فیلتر عبور داده و برای ممانعت از رشد قارچ چند قطره سدیم آزاید به آن اضافه گردید.
۳-۸. شمارش سلولی
به منظور شمارش سلولی، پس از تریپسینه کردن و جدا نمودن سلول‌ها از کف فلاسک محیط حاوی سلول به لوله استریل منتقل شده و با دور ۱۰۰۰ rpm به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی دور ریخته شد و ۱ ml از محیط DMEM به رسوب اضافه و با پیپت پاستور استریل کاملاً مخلوط گردید، سپس با استفاده از لام نئوبار تعداد سلول‌ها در خانه‌های مربوط به گلبول سفید شمارش شد و از فرمول زیر تعداد سلول‌ها در ۱ ml محاسبه شد.
تعداد سلول در ۱۰۴ = ۱ ml × میانگین تعداد سلول‌های شمارش در ۴ خانه
۳-۹. تعیین درصد زنده بودن سلول‌ها
جهت تعیین درصد سلول‌های زنده، ۱۰۰ ?lاز سوسپانسیون سلولی با ۱۰۰ ?l رنگ تریپان ۴% مخلوط شده، پس از ۲ تا ۳ دقیقه یک قطره از این مخلوط را برداشته و یا استفاده از لام نئوبار و در خانه‌های مربوط به شمارش گلبول سفید تعداد سلول‌ها شمارش شد. به دلیل وجود پمپ‌های سدیم و پتاسیم رنگ تریپان بلو در سلول‌های زنده باقی نمی‌ماند در صورتی که در سلول‌های مرده رنگ نفوذ کرده و نمی‌تواند خارج شود لذا سلول‌های مرده رنگ آبی را به خود می‌گیرند. با شمارش سلول‌های زنده‌ی بی‌رنگ و سلول‌های مرده‌ی آبی رنگ و با استفاده از فرمول زیر درصد زنده بودن سلول‌ها تعیین شد.
درصد زنده بودن سلول‌ها = تعداد سلول‌های زنده/ تعداد کل سلول‌ها
۳-۱۰. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی
پس از تیمار سلول‌های فیبروبلاست با لیپو پلی ساکارید طبق روشی که قبلاً به آن اشاره شد، سلول‌ها تحت‌تأثیر بافر لیز کننده قرار گرفتند و پس از ورتکس، فریز شدند. سنجش نیتریک اکسید به کمک کیت رنگ سنجی (Nitric Oxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. با توجه به اینکه نیمه عمر نیتریک اکسید کم بوده و ناپایدار است سریعاً به نیتریت و نیترات، اکسید می‌شود. که این محصولات برای تعیین میزان نیتریک اکسید مد نظر قرار می‌گیرند. اساس این کیت در دو مرحله خلاصه می‌شود. در مرحله‌ی اول نیترات توسط نیترات ردوکتاز به نیتریت تبدیل می‌شود. در مرحله‌ی دوم با استفاده از معرف گریس۹۹، نیتریت به ترکیبی با رنگ ارغوانی تبدیل می‌شود.
۳-۱۰-۱. آماده‌سازی نمونه‌ها
۸۵ ماکرولیتر از نمونه‌ها برای هر سنجش استفاده شد که دو مرتبه باید انجام می‌گرفت. در صورتیکه کمتر از این مقدار استفاده شود باید با بافر حجم آنها را به ۸۵ ماکرولیتر رساند. برای هر نمونه یک بلانک در نظر گرفته شد.
۳-۱۰-۲. روش کار
برای بلانک‌های هر نمونه (با حجم ۸۵ ماکرولیتر) مقدار ۱۱۵ ماکرولیتر از بافر اضافه شد. برای نمونه‌ها ۵ ماکرولیتر از نیترات ردوکتاز به هر چاهک اضافه شد. سپس ۵ ماکرولیتر کوفاکتور آنزیم به هر چاهک اضافه شد. پلیت مربوطه پوشانده شد و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید تا نیترات به نیتریت تبدیل شود. سپس ۵ ماکرولیتر از تقویت کننده۱۰۰ به هر چاهک اضافه شده و به مدت ۱۰ دقیقه ا
نکوبه شد. در مرحله‌ی بعد ۵۰ ماکرولیتر از معرف گریس R1 و ۵۰ ماکرولیتر هم از معرف گریس R2 به هر چاهک اضافه شد. بعد از ۱۰ دقیقه تغییر رنگ مشاهده می‌شود. این تغییر رنگ تا یک ساعت پایدار می‌باشد. میزان جذب توسط پلیت ریدر و در طول موج ۵۴۰ نانومتر خوانده شد.
۳-۱۱. تعیین میزان هیدروژن پراکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی
سلول‌های فیبروبلاست در پلیت‌های ۹۶ خانه به مدت ۲۴ ساعت کشت داده شدند سپس مورد تیمار غلظت‌های مختلف از لیپو پلی ساکارید قرار گرفتند. این سلول‌ها در سه مدت زمان ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت مورد بررسی قرار گرفتند. بطوری که به ازای هر ?l 100 سلول و محیط کشت، ۱۰۰ ?l بافر لیز کننده به هر چاهک اضافه گردید و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. محتویات چاهک‌ها به میکروتیوب‌های ۲ ml انتقال داده شد و به مدت ۱ دقیقه ورتکس شدند. این نمونه‌ها فریز شده و برای سنجش آماده شدند. سنجش پراکسید هیدروژن با کیت کلرومتریک (Hydrogen peroxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. اساس این کیت بر این قرار است که در حضور HRP101، OxiRedTM Probe با هیدروژن پراکسید وارد واکنش شده تا محصولی رنگی با بیشینه طول موج ۵۷۰ نانومتر تولید شود.
۳-۱۱-۱. آماده‌سازی نمونه‌ها:
سوپرناتانت کشت سلولی (حاوی ۶-۸/۰ میکرومولار H2O2) به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰g سانتریفیوژ شده و تکمه یا پلت سلولی حذف شد. نمونه‌های محیط کشت سلولی باید توسط فیلتر چرخشی۱۰۲ kDa MW (Biovision, Cat 1997-25)10 فیلتر می‌شدند تا تمام پروتئین‌ها خارج شوند. سپس در دمای ۸۰- درجه نگهداری شدند. ۵۰-۲ ماکرولیتر از نمونه‌ها به هر چاهک ریخته شد و حجم آنها با بافر به حجم ۵۰ ماکرولیتر رسانده شد.
۳-۱۱-۲. منحنی استاندارد H2O2:
۱۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید۱۰۳ (۰/۸۸M) در ۸۷۰ ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) ایجاد شود. سپس ۱۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (۱۰mM) را در ۹۹۰ ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) ایجاد شود. مقادیر ۰، ۱۰، ۲۰، ۳۰، ۴۰، ۵۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) دو مرتبه در چاهک‌های پلیت ۹۶ خانه ریخته شد تا مقادیرnmol 0، ۱، ۲، ۳، ۴، ۵ در هر چاهک ایجاد شود.
۳-۱۱-۳. مخلوط واکنش:
برای هر چاهک ۵۰ ماکرولیتر از مخلوط واکنش۱۰۴ آماده شد که شامل ۴۶ ماکرولیتر بافر، ۲ ماکرولیتر محلول OxiRedTM Probe و ۲ ماکرولیتر محلول HRP بود. ۵۰ ماکرولیتر از مخلوط واکنش به چاهک‌های حاوی نمونه و استاندارد هیدروژن اضافه شده، به خوبی مخلوط شده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. سپس


0 Comments

No Comment.

Related Posts

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد حقوق مالکیت فکری

می آید که کشورهای عضو می توانند ضمانت اجراهای کیفری نیز برای مقابله با اعمال ناقض حقوق مالکیت فکری اتخاذ کنند. دستورالعمل همچنین بر موثر و متناسب بودن و ویژگی پیشگیرانه این ضمانت اجراها تأکید Read more…

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد حقوق مالکیت فکری

این عنوان مورد حمایت واقع شده اند.   با این حال، با کمال تعجب ماده 108 قانون مالکیت فکری آلمان ناظر بر حمایت کیفری از حقوق جانبی که پیش تر در مورد آن صحبت شد، Read more…

پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه درمورد مقررات بین المللی

مقامهای آنان باشد. مرتکبان این جرائم هم، هر کسی است که نسبت به ثبت یا ضبط آثار به هر وسیله ای و بر روی هر واسطی بدون اجازه صاحبان حقوق به مفهوم عام کلمه اقدام Read more…